# Projet G4PLAST1

RNA seq single end.
2 lignées, WT et OXRSH1
2 conditions, MS2 et N50

## Vérification de la qualité des séquences

#### 1- Utilisation de FASTQC (--version 0.11.5)

> Andrews S. (2010). FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Available online at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc

    cecile@cecile-vm-linux:~
    $ cd '/home/cecile/tmp/FastQC'

#### 2- Ouverture d'une interface graphique pour FASTQC

    cecile@cecile-vm-linux:~/tmp/FastQC
    $ ./fastqc

## Alignement contre le transcriptome avec bowtie2

Avec Bowtie2 (--version 2.2.9)

> Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.

On aligne contre Araport en utilisant : `Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model.fa`

#### 1- Faire l'index

Dans le dossier `/path_to/Ref_files`

    $ mkdir Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model_bowtie2_index

    $ bowtie2-build Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model.fa Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model_bowtie2_index/At

#### 2- Faire l'alignement

Dans le dossier `/path_to/G4PLAST1`

Créer un répertoire pour les alignements

    $ mkdir bowtie2_align

Faire l'alignement

    $ for F in *.fastq; do echo "=> $F"; bowtie2 --nofw  -p 2 --local -x /home/cecile/partage/Data/ref_files/Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model_bowtie2_index/At -U $F | samtools view -bT  /home/cecile/partage/Data/ref_files/Araport11_cdna_20160703_representative_gene_model.fa > ~/partage/F/G4PLAST1/bowtie2_align/${F%.*}.bam; done 2>&1 | tee ~/partage/F/G4PLAST1/bowtie2_align/bowtie.log

#### 3- Trier par coordonnées

    $ mkdir bowtie2_align_sorted

Se placer dans le dossier `/path_to/bowtie2_align`

    $ for F in *.bam; do echo "=> $F"; samtools sort $F > ~/partage/F/G4PLAST1/bowtie2_align_sorted/${F%.*}_sorted.bam; done

## Comptage des reads

Créer un répertoire

    $ mkdir count

Le comptage ne peut pas être réalisé avec HTseq-count dans le cas d'un alignement contre le transcriptome. J'utilise une commande dérivé de celle décrite dans :

> RNA-Seq : revelation of the messengers. Pieterse MJ, Verk MC Van, Hickman R, Wees SCM Van (2013). Trends Plant Sci 18:175–179.

    $ samtools view -h file.bam | perl -wane 'if (/^\@/) { if (/^\@SQ/) { $trans = $F[1]; $trans =~ s/^SN://; $h{$trans} = 0 } } else { $trans = $F[2]; $h{$trans}++ } END { for $trans (sort keys %h) { print "$trans\t$h{$trans}\n" } }' > ~/partage/F/G4PLAST1/count/file.count

## Etude statistique et génération du fichier d'expression des gènes avec SARTools

> Varet, Hugo and Brillet-Guéguen, Loraine and Coppée, Jean-Yves and Dillies, Marie-Agnès (2016). SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data. In PLoS ONE, 11 (6), pp.

#### 1- Création du fichier `target.txt`

Il est necessaire de créer un fichier contenant des colonnes séparées par des tabulations. Ce fichier permet de décrire les conditions dans lesquelle la manipulation a été faite (nombre de réplicat, date...)

Pour la comparaison OXRSH1_MS2 vs WT_MS2

    label       files                       group   batch
    wt_1        WT_MS2_1_sorted.count       WT      day1
    wt_2        WT_MS2_2_sorted.count       WT      day2
    wt_3        WT_MS2_3_sorted.count       WT      day3
    oxrsh1_1    OXRSH1_MS2_1_sorted.count   OXRSH1  day1
    oxrsh1_2    OXRSH1_MS2_2_sorted.count   OXRSH1  day2
    oxrsh1_3    OXRSH1_MS2_3_sorted.count   OXRSH1  day3

On crée le même fichier pour chaque comparaison

#### 2- Utilisation du script `template_script_Edge.r`

Il faut ouvrir une console Rstudio et remplir les paramètres propres à chaque condition :

      ################################################################################
      ### R script to compare several conditions with the SARTools and edgeR packages
      ### Hugo Varet
      ### November 28th, 2019
      ### designed to be executed with SARTools 1.7.3
      ################################################################################

      ################################################################################
      ###                parameters: to be modified by the user                    ###
      ################################################################################
    rm(list=ls())                                        # remove all the objects from the R session

    workDir <- "/home/cecile/partage/F/G4PLAST1/sartools_OXRSH1_MS2_vs_WT_MS2"      # working directory for the R session

    projectName <- "G4PLAST1"                         # name of the project
    author <- "Cécile"                                # author of the statistical analysis/report

    targetFile <- "target_file.txt"                           # path to the design/target file
    rawDir <- "/home/cecile/partage/F/G4PLAST1/count"                                      # path to the directory     containing raw counts files
    featuresToRemove <- c("alignment_not_unique",        # names of the features to be removed
                      "ambiguous", "no_feature",     # (specific HTSeq-count information and rRNA for example)
                      "not_aligned", "too_low_aQual")# NULL if no feature to remove

    varInt <- "group"                                    # factor of interest
    condRef <- "WT"                                      # reference biological condition
    batch <- "batch"                                        # blocking factor: NULL (default) or "batch" for example

    alpha <- 0.05                                        # threshold of statistical significance
    pAdjustMethod <- "BH"                                # p-value adjustment method: "BH" (default) or "BY"

    cpmCutoff <- 1                                       # counts-per-million cut-off to filter low counts
    gene.selection <- "pairwise"                         # selection of the features in MDSPlot
    normalizationMethod <- "TMM"                         # normalization method: "TMM" (default), "RLE" (DESeq) or "upperquartile"

    colors <- c("#f3c300", "#875692", "#f38400",         # vector of colors of each biological condition on the plots
            "#a1caf1", "#be0032", "#c2b280",
            "#848482", "#008856", "#e68fac",
            "#0067a5", "#f99379", "#604e97")

    forceCairoGraph <- FALSE

Puis on exécute le script

On obtient, pour chaque condition, un rapport statistique et 3 fichiers `.txt` contenant les valeurs chiffrées de l'expression différentielle des gènes : une liste complète, une liste des gènes réprimés et une liste des gènes activés.